Cómo elegir enzimas de restricción

Las enzimas de restricción son enzimas que cortan ambos ADN de una y doble cadena. Cada enzima de restricción tiene una secuencia de nucleótidos específica, denominada sitio de restricción, que reconoce y corta. Las enzimas de restricción se utilizan para la secuenciación de ADN, análisis mutacional, y la clonación y la amplificación de ADN. Los científicos usan enzimas de restricción para insertar genes de interés en vectores de expresión, moléculas de ADN que pueden replicarse por separado a partir de ADN cromosómico. El vector que contiene el gen de interés puede entonces ser introducido en una cepa bacteriana para la expresión y caracterización de proteínas.

Nivel de dificultad:
Moderadamente difícil

Necesitarás

  • Secuencia de inserto de genes
  • Mapa de restricción para el vector elegido
  • Lista de enzimas de restricción y sus sitios de corte

Instrucciones

  1. Identifica los sitios de enzimas de restricción en tu vector mirando un mapa de restricción. El mapa de restricción te dirá qué enzimas cortarán tu vector, y dónde.

  2. Elige una enzima de restricción que también tenga un sitio presente en el inserto del gen, al observar la secuencia del inserto. Asegúrate de que el sitio de restricción está en una posición en la inserción que está fuera del gen de interés, por lo que no pierdes ninguna parte del gen.

  3. Asegúrate de que no haya duplicados del sitio de restricción en cualquier lugar de su inserción génica o vector. Esto provocará cortes múltiples en tu ADN y te dará datos engañosos.

  4. Trata de elegir las enzimas de restricción que cortan extremos cohesivos, en lugar de extremos romos. Los extremos pegajosos se producen cuando la enzima corta ADN de cadena doble de una manera escalonada, dejando una sola hebra voladiza que facilita la fijación con un corte de inserción en la manera opuesta. Los extremos obtusos ocurren cuando el ADN de doble hebra se corta de una manera suave, y éstos son más difíciles de unir.

  5. Elige una enzima de restricción diferente para los dos extremos de tu inserción para asegurarte de que se inserta en el vector en la orientación adecuada y garantizar que el vector no vuelva a adjuntarse a sí mismo.

  6. Trata de elegir dos enzimas de restricción que funcionan bien en el mismo sistema tampón y temperatura. Si esto no es posible, ejecuta cada digestión por separado.

Consejos y advertencias

  • Algunos programas de la web se han desarrollado para identificar los sitios de restricción de una secuencia de ADN con rapidez. Uno de estos programas es de New England Biolabs.

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Escrito por renda hawwa, ph.d. | Traducido por blas isaguirres